益母草提取物对大鼠高尿酸血症的调控作用(2)

2.3 血液、尿液及组织标本制备连续7 d给予造模及治疗药物后，大鼠放入代谢笼中禁食不禁水，收集24 h尿液，眼内眦取血，常温静止30 min，5 000 r·min-1，4 ℃离心10 min，分离上清，待用;尿液处理：5 000 r·min-1，4 ℃离心10 min，分离上清。并将大鼠处死，取肾脏，-70 ℃保存待用。

　　2.4 血清尿酸、肌酐及尿尿酸测定采用尿酸测定试剂盒和肌酐测定试剂盒测定。

　　2.5 RT-PCR法测定肾脏相关转运体的表达取100 mg左右肾组织，加入1 mL Trizol，冰浴研磨匀浆，将匀浆液移至离心管中，4 ℃，12 000×g离心5 min;将上清移至新离心管，室温静置5 min，使其充分裂解，加入0.2 mL氯仿，混匀至充分乳化，室温静置2～3 min;12 000×g 4 ℃离心15 min，将上层水相移至另一管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀后-70 ℃过夜;再次4 ℃，12 000×g离心10 min，弃上清;加1 mL 75%乙醇漂洗1次，再4 ℃，8 000×g离心5 min，弃上清，放置待乙醇蒸发后加10～30 μL无RNA 酶水溶解，至-70 ℃冰箱保存待用。用紫外分光光度计测定260，280 nm吸光度比值，计算RNA纯度。按High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits说明进行反转录成，合成cDNA。

　　引物根据NCBI公布的大鼠基因序列，设计上下游引物： mURAT1（5′-GCTACCAGAATCGGCACGCT-3′，5′-CACCGGGAAGTCCACAATCC-3′）;mGLUT9（5′-GAGATGCTCATTGTGGGACG-3′， 5′-GT GCTACTTCGTCCTCGGT-3′）;mOCT1（5′-ACATCCATGTTGCTCTTTCG-3′，5′-TTGCTCCATTATCCTTACCG-3′）;mOCT2（5′-ACAGGTTTGGGCGGAAGT-3′， 5′-CACCAGAAATAGAGCAGGAAG-3′）;mOCTN1（5′-TGTTCTTCGTAGGCGTTCT-3′， 5′-TGGAATAAACCACCACAGG-3′）;mOCTN2（5′-TCTACGAAGCCTCAGTTGC-3′， 5′-ATTCCTTTGACCCTTAGCAT-3′）;GAPDH（5′-GAGAAGATTTGGCACCACAC-3′，5′-CATCACAATGCCAGTGGTAC-3′）。根据Power SYBR GREEN PCR MASTER MIX试剂盒说明应用Applied Biosystems 7500 Real-time PCR System进行实验。将10 ng样品cDNA、5 μmol引物和10 μL Power SYBRGREEN PCR MASTER MIX溶于DEPC水，总体积为20 μL，置于PCR管中反应。反应条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸5 min，共40个循环。应用2-ΔΔCt方法计算各基因相对含量。

　　2.6 数据处理应用SPSS 11.5统计软件分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。

　　3 结果

　　3.1 益母草提取物对高尿酸血症大鼠血清尿酸、肌酐及尿酸的影响与正常组相比，模型组血清尿酸、肌酐水平显著上升（P<0.01），尿尿酸水平显著下降（P<0.05）。与模型组相比，别嘌醇组血清尿酸水平显著下降（P<0.01），肌酐水平有所下降，但无显著性差异，尿中尿酸水平也明显下降，论文答辩但无显著性差异;益母草提取物各剂量组血清尿酸水平显著下降（P<0.05，P<0.01），各剂量组血清肌酐水平显著下降（P<0.05），益母草中、低剂量组尿尿酸水平显著上升（P<0.05），见表1。

　　3.2 益母草提取物对高尿酸血症大鼠肾脏尿酸转运体的影响与正常组相比，模型组肾脏URAT1，GLUT9 mRNA 的表达显著升高（P<0.05，P<0.01）;与模型组相比，别嘌醇组URAT1，GLUT9 mRNA表达下降，其中URAT1有显著性差异（P<0.05）;益母草提取物各组URAT1 mRNA的表达显著下降（P<0.05），GLUT9 mRNA的表达下降，其中益母草提取物高剂量组有显著性差异（P<0.05），见图1。

　　与正常组相比，模型组OCT1，OCT2 mRNA 表达显著下降（P<0.05，P<0.01）;与模型组相比，别嘌醇组OCT1，OCT2 mRNA 表达上升，其中OCT2 mRNA 表达有显著性差异（P<0.05）;益母草提取物各剂量组OCT1 mRNA表达均显著上升（P<0.05），OCT2 mRNA表达上升，其中高、低剂量组有显著性差异（P<0.01），见图2。

　　与正常组相比，模型组OCTN1，OCTN2 mRNA表达显著降低（P<0.01，P<0.001）;别嘌醇组OCTN1，OCTN2 mRNA 表达上升，其中OCTN2 mRNA 表达有显著性差异（P<0.05）;益母草提取物高、低剂量组OCTN1 mRNA表达显著上升（P<0.05），各剂量组 OCTN2 mRNA表达均显著上升（P<0.01，P<0.001），见图3。

　　4 讨论

　　高尿酸血症的主要表现为体内尿酸蓄积，主要成因包括2个方面：①尿酸生成或多，可能与摄入过多高嘌呤食物，或者与嘌呤代谢相关的酶发生异常有关;②尿酸排泄减少，肾脏是尿酸排泄的主要部位，如果肾脏功能发生异常，则会使尿酸无法排出体外，从而造成尿酸在体内的蓄积。同时，过多的尿酸盐在肾脏中发生结晶，也会进一步影响肾脏的排泄功能。

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